М. С. Донесевич, нс, к. с.-х. н.
Москва
Moscow
Е. Д. Ахба, мнс
Москва
Moscow
В данной работе представлен сравнительный анализ спектрофотометрических характеристик результатов выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из растительного материала ягодных культур различными методами. Апробация данных протоколов на ягодных культурах либо не осуществлялась, либо была апробирована частично. С целью повышения эффективности протокола с наиболее оптимальными спектрофотометрическими характеристиками исследовано влияние продолжительности осаждения хлоридом лития, времени лизиса, отмывки абсолютным этанолом, добавления лаурилсульфата натрия (SDS) и модификации хлороформной экстракции. Для протокола, показавшего значения, наиболее приближенные к оптимальным, сделано шесть вариантов модификаций, которые затронули различные этапы выделения РНК. Установлено, что для земляники садовой, смородины черной и малины наилучшие спектрофотометрические характеристики были у варианта модификации с сочетанием длительного осаждения (16 ч) и увеличения концентрации спиртового раствора. Наблюдаемое низкое стандартное отклонение по измеряемым параметрам свидетельствует о высокой степени воспроизводимости метода, что является ключевым показателем его надежности и точности в контексте молекулярных исследований. С помощью одноэтапной ОТ-ПЦР с внутренними контрольными праймерами к гену nad5 подтверждено отсутствие ингибиторов полимеразной цепной реакции в образцах РНК, полученных модифицированным методом. Это доказывает пригодность выделенной РНК для высокочувствительной диагностики фитопатогенных вирусов. Перспективы дальнейших исследований включают применение оптимизированного протокола для выделения РНК и дальнейшей апробации праймеров для идентификации фитопатогенных вирусов на этапе сертификации растений высших категорий качества.
This paper presents a comparative analysis of the spectrophotometric characteristics of total RNA isolated from berry crop plant material using various extraction methods. Evaluation of isolation protocols in berry crops has either not been conducted or has been limited in scope. The protocol that demonstrated the most favorable spectrophotometric characteristics was optimized by investigating the effects of lithium chloride coprecipitation time, lysis time, washing with absolute ethanol, sodium lauryl sulfate (SDS) addition, and modification of the chloroform extraction step. Six modifications affecting different stages of RNA extraction were developed for the protocol that produced values closest to the optimal range. For garden strawberry, black currant, and raspberry, the most favorable spectrophotometric characteristics were obtained using the modified protocol combining prolonged coprecipitation (16 h) with an increased concentration of the alcohol solution. The low standard deviations of the measured parameters indicate a high degree of method reproducibility, which is an important indicator of its reliability and accuracy for molecular research. One-step RT-PCR using internal control primers targeting the nad5 gene was performed to confirm the absence of polymerase chain reaction inhibitors in RNA samples obtained using the modified method. These results demonstrate the suitability of the isolated RNA for highly sensitive diagnostics of phytopathogenic viruses. Further research will focus on applying the optimized RNA extraction protocol and evaluating primers for the identification of phytopathogenic viruses during the certification of plants in the highest quality categories.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.