Optimization of a method for RNA isolation from berry crops for subsequent molecular diagnostics

 This paper presents a comparative analysis of the spectrophotometric characteristics of total RNA isolated from berry crop plant material using various extraction methods. Evaluation of isolation protocols in berry crops has either not been conducted or has been limited in scope. The protocol that demonstrated the most favorable spectrophotometric characteristics was optimized by investigating the effects of lithium chloride coprecipitation time, lysis time, washing with absolute ethanol, sodium lauryl sulfate (SDS) addition, and modification of the chloroform extraction step. Six modifications affecting different stages of RNA extraction were developed for the protocol that produced values closest to the optimal range. For garden strawberry, black currant, and raspberry, the most favorable spectrophotometric characteristics were obtained using the modified protocol combining prolonged coprecipitation (16 h) with an increased concentration of the alcohol solution. The low standard deviations of the measured parameters indicate a high degree of method reproducibility, which is an important indicator of its reliability and accuracy for molecular research. One-step RT-PCR using internal control primers targeting the nad5 gene was performed to confirm the absence of polymerase chain reaction inhibitors in RNA samples obtained using the modified method. These results demonstrate the suitability of the isolated RNA for highly sensitive diagnostics of phytopathogenic viruses. Further research will focus on applying the optimized RNA extraction protocol and evaluating primers for the identification of phytopathogenic viruses during the certification of plants in the highest quality categories.

1. Упадышев М. Т. и др. Диагностика вирусных болезней и выделение кандидатов в исходные растения земляники садовой ex situ, Плодоводство и ягодоводство России. 2020;61:103-108. DOI: 10.31676/2073-4948-2020-61-103-108.

2. Bird G., Yan G. Plant Diseases Caused by Nematode-vectored Viruses, Nematode Disease Complexes in Agricultural Crops. GB: CABI, 2025;169-198. DOI: 10.1079/9781800625228.0009.

3. Yurtmen M. Raspberry and blueberry viruses, Edible Berries-New Insights. IntechOpen, 2023. DOI: 10.5772/INTECHOPEN.1001860.

4. Волков Ю. Г., Какарека Н. Н., Толкач В. Ф., Щелканов М. Ю. Вирусные заболевания плодово-ягодных культур на юге российского Дальнего Востока, Юг России: экология, развитие. 2022;17(4):88-100. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-88-100.

5. Кухарчик Н. В. и др. Методика диагностики вирусных и фитоплазменных инфекций плодовых, ягодных, орехоплодных культур и винограда. Национальная академия наук Беларуси, «Институт плодоводства»; разраб.: Н. В. Кухарчик и др. Минск: Колорград, 2025, 27.

6. Митрофанова И. В., Чирков С. Н. Современные подходы к диагностике вирусных болезней и биотехнологии оздоровления садовых культур, Научное издание. 2024, 32.

7. Лиховской В. В. и др. Методологические основы сертификации маточников и посадочного материала винограда, 2022.

8. Кухарчик Н. В. и др. Методика диагностики основных вирусных инфекций плодовых и ягодных культур, Плодоводство. 2022;27:341-349.

9. Frederick M. A., Brent Roger, Robert E. K. et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 2003. 4.1.1-4.1.5

10. Кузнецова О. В. Биологически активные вещества листьев земляники лесной, Горизонты биофармацевтики: Сборник научных трудов по материалам VII Международной научно-практической молодежной конференции, посвященной 86-летию Курского государственного медицинского университета, Курск, 23 декабря 2021 года. Курск: Курский государственный медицинский университет, 2021, 87-89.

11. Кудинова А. М. Фитохимический анализ листьев малины обыкновенной (Rubus idaeus L.). Научные исследования молодых учёных: сборник статей X Международной научно-практической конференции, Пенза, 23 марта 2021 года. Пенза: «Наука и Просвещение», 2021, 188-191.

12. Тихонова О. А., Стрельцина С. А. Устойчивость образцов смородины черной к американской мучнистой росе (Sphaerotheca mors-uvae (Schw.) Berk. et Curt.) в условиях Северо-Запада России, Плодоводство. 2022;23:313-322.

13. Упадышев М. Т. Роль фенольных соединений в процессах жизнедеятельности садовых растений; Российская акад. с.-х. наук. Москва: ВСТИСП: Изд. Дом МСП, 2008, 319.

14. Demeke T., Adams R. P. The eff ects of plant polysaccharides and buff er additives on PCR, BioTechniques, 1992;12:332-334.

15. Morante-Carriel J. et al. RNA isolation from loquat and other recalcitrant woody plants with high quality and yield, Analytical Biochemistry. 2014;452:46-53. DOI: 10.1016/j.ab.2014.02.010.

16. Аубакирова К. и др. Улучшенный метод выделения РНК для молекулярной диагностики вирусов плодово-ягодных культур, Izdenister natigeler. 2024;3(103):108-114. DOI: 10.37884/3-2024/12.

17. Песнев В. Б., Федорович С. В. Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия, Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия. 2024;38:50-55

18. Khan S. et al. Development of a duplex one-step RT-qPCR assay for the simultaneous detection of Apple scar skin viroid and plant RNA internal control, Journal of Virological Methods. 2015;221:100-105. DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.04.032.