Оптимизация способа выделения РНК из растений ягодных культур для использования в дальнейшей молекулярной диагностике

В данной работе представлен сравнительный анализ спектрофотометрических характеристик результатов выделения тотальной рибонуклеиновой кислоты из растительного материала ягодных культур различными методами. Апробация данных протоколов на ягодных культурах либо не осуществлялась, либо была апробирована частично. С целью повышения эффективности протокола с наиболее оптимальными спектрофотометрическими характеристиками исследовано влияние продолжительности осаждения хлоридом лития, времени лизиса, отмывки абсолютным этанолом, добавления лаурилсульфата натрия (SDS) и модификации хлороформной экстракции. Для протокола, показавшего значения, наиболее приближенные к оптимальным, сделано шесть вариантов модификаций, которые затронули различные этапы выделения РНК. Установлено, что для земляники садовой, смородины черной и малины наилучшие спектрофотометрические характеристики были у варианта модификации с сочетанием длительного осаждения (16 ч) и увеличения концентрации спиртового раствора. Наблюдаемое низкое стандартное отклонение по измеряемым параметрам свидетельствует о высокой степени воспроизводимости метода, что является ключевым показателем его надежности и точности в контексте молекулярных исследований. С помощью одноэтапной ОТ-ПЦР с внутренними контрольными праймерами к гену nad5 подтверждено отсутствие ингибиторов полимеразной цепной реакции в образцах РНК, полученных модифицированным методом. Это доказывает пригодность выделенной РНК для высокочувствительной диагностики фитопатогенных вирусов. Перспективы дальнейших исследований включают применение оптимизированного протокола для выделения РНК и дальнейшей апробации праймеров для идентификации фитопатогенных вирусов на этапе сертификации растений высших категорий качества.

1. Упадышев М. Т. и др. Диагностика вирусных болезней и выделение кандидатов в исходные растения земляники садовой ex situ, Плодоводство и ягодоводство России. 2020;61:103-108. DOI: 10.31676/2073-4948-2020-61-103-108.

2. Bird G., Yan G. Plant Diseases Caused by Nematode-vectored Viruses, Nematode Disease Complexes in Agricultural Crops. GB: CABI, 2025;169-198. DOI: 10.1079/9781800625228.0009.

3. Yurtmen M. Raspberry and blueberry viruses, Edible Berries-New Insights. IntechOpen, 2023. DOI: 10.5772/INTECHOPEN.1001860.

4. Волков Ю. Г., Какарека Н. Н., Толкач В. Ф., Щелканов М. Ю. Вирусные заболевания плодово-ягодных культур на юге российского Дальнего Востока, Юг России: экология, развитие. 2022;17(4):88-100. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-88-100.

5. Кухарчик Н. В. и др. Методика диагностики вирусных и фитоплазменных инфекций плодовых, ягодных, орехоплодных культур и винограда. Национальная академия наук Беларуси, «Институт плодоводства»; разраб.: Н. В. Кухарчик и др. Минск: Колорград, 2025, 27.

6. Митрофанова И. В., Чирков С. Н. Современные подходы к диагностике вирусных болезней и биотехнологии оздоровления садовых культур, Научное издание. 2024, 32.

7. Лиховской В. В. и др. Методологические основы сертификации маточников и посадочного материала винограда, 2022.

8. Кухарчик Н. В. и др. Методика диагностики основных вирусных инфекций плодовых и ягодных культур, Плодоводство. 2022;27:341-349.

9. Frederick M. A., Brent Roger, Robert E. K. et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 2003. 4.1.1-4.1.5

10. Кузнецова О. В. Биологически активные вещества листьев земляники лесной, Горизонты биофармацевтики: Сборник научных трудов по материалам VII Международной научно-практической молодежной конференции, посвященной 86-летию Курского государственного медицинского университета, Курск, 23 декабря 2021 года. Курск: Курский государственный медицинский университет, 2021, 87-89.

11. Кудинова А. М. Фитохимический анализ листьев малины обыкновенной (Rubus idaeus L.). Научные исследования молодых учёных: сборник статей X Международной научно-практической конференции, Пенза, 23 марта 2021 года. Пенза: «Наука и Просвещение», 2021, 188-191.

12. Тихонова О. А., Стрельцина С. А. Устойчивость образцов смородины черной к американской мучнистой росе (Sphaerotheca mors-uvae (Schw.) Berk. et Curt.) в условиях Северо-Запада России, Плодоводство. 2022;23:313-322.

13. Упадышев М. Т. Роль фенольных соединений в процессах жизнедеятельности садовых растений; Российская акад. с.-х. наук. Москва: ВСТИСП: Изд. Дом МСП, 2008, 319.

14. Demeke T., Adams R. P. The eff ects of plant polysaccharides and buff er additives on PCR, BioTechniques, 1992;12:332-334.

15. Morante-Carriel J. et al. RNA isolation from loquat and other recalcitrant woody plants with high quality and yield, Analytical Biochemistry. 2014;452:46-53. DOI: 10.1016/j.ab.2014.02.010.

16. Аубакирова К. и др. Улучшенный метод выделения РНК для молекулярной диагностики вирусов плодово-ягодных культур, Izdenister natigeler. 2024;3(103):108-114. DOI: 10.37884/3-2024/12.

17. Песнев В. Б., Федорович С. В. Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия, Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия. 2024;38:50-55

18. Khan S. et al. Development of a duplex one-step RT-qPCR assay for the simultaneous detection of Apple scar skin viroid and plant RNA internal control, Journal of Virological Methods. 2015;221:100-105. DOI: 10.1016/j.jviromet.2015.04.032.